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elisa实验中的包被要注意哪些问题
点击次数:30      发布时间:2021-08-12

通常大家在进行Elisa试剂盒的实验的时候,需要注意一些问题,例如温育、显色、包被等。其中,包被是需特别注意的一个问题,直接关系到实验的效果。那么在实验的时候包被要注意哪些问题呢?


   首先大家要知道什么是包被。


   在ELISA试剂盒实验时将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的,靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的,受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。

ELISA试剂盒

   大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团,故更易吸附到固相载体表面。不易吸附的非蛋白质抗原可用间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用,包被在固相上的抗原纯度大大提高,因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法。


   亲和素生物素  即用亲和素先包被载体,加入生物素化的DNA,这种包被方法均匀、牢固,已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。脂类物质无法与固相载体结合,可将其在有机溶剂(例如乙醇)中溶解后加入ELISA板孔中,开盖置冰箱过夜或冷风吹干,待酒精挥发后,让脂质自然干固在固相表面。

   优点:试验的特异性、敏感性均由此得以改善,重复性亦佳。抗原用量少,仅为直接包被的1/10乃至于/100。


   其次包被主要用哪些。


   1、包被用抗原。

   天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一个抗原决定簇,纯度高,特异性也高,但由于分子量太小,往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体的吸附,间接地结合到固相载体表面。

   2、包被用抗体

   IgG对聚苯乙烯有强吸附力,其联结发生在Fc段上,抗体结合点暴露于外。取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液.须除去杂抗体后才能用于ELISA,以保证试验的特异性。

   腹水中单抗的浓度较高,特异性亦较强,因此不需要作吸取层析处理,直接包被。在某些情况下,用多种单抗混合包被,可取得更好的效果。


   最后包被需要哪些条件。


   pH9.6碳酸盐缓冲液

   pH7.2的磷酸盐缓冲液

   pH7-8的Tris-HCL缓冲液

   加入包被液后,在4-8℃冰箱中放置过夜,37℃中保温2小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化,每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为10ng/ml-20ug/ml。



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